Offentlig dataanalyse
Data om SARS-CoV-2 slægter og datoen for prøven blev taget fra de sekvenser, der var tilgængelige fra Chile, blev hentet fra Consorcio Genomas CoV2-stedet, der var tilgængeligt på https://auspice.cov2.cl/ncov/chile-global. Vaccinationsdata blev indhentet fra offentlige data fra Ministeriet for Videnskab, Teknologi, Viden og Innovation tilgængelig på https://github.com/MinCiencia/Datos-COVID19 (Produkt 83).
Infektionsassay
Pseudotypede vira, der bærer forskellige SARS-CoV-2 spike-proteiner, blev fremstillet som vi tidligere har beskrevet12. I korte træk blev HIV-1-baserede SARS-CoV-2 pseudotyper produceret i HEK293T-celler ved transfektion af pNL4.3-ΔEnv-Luc sammen med den tilsvarende pCDNA-SARS-CoV-2 Spike-kodende vektor i et 1: 1 molforhold. Plasmider, der koder for en kodonoptimeret spike, der mangler de sidste 19 aminosyrer i den C-terminale ende (SΔ19), som vides at undgå tilbageholdelse ved det endoplasmatiske retikulum12 blev opnået ved gensyntese eller tilpasset stedrettet mutagenese (GeneScript) og indeholdt følgende mutationer: afstamning A (referencesekvens), afstamning B (D614G), afstamning B.1.1.7 (Δ69-70, Δ144, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H), slægt P.1 (L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, T1027I) og slægt C.37 (G75V, T76I, 246, L252Q, F452S, D490G, T614N). Hvert pseudotypepræparat blev ryddet ved centrifugering ved 859 omdr./min. Ved stuetemperatur, kvantificeret ved hjælp af HIV-3,000 Gag p1 Quantikine ELISA Kit (R&D Systems), alikvoteret i 24% føtalt bovint serum (Sigma-Aldrich) og opbevaret ved -50 ° C indtil brug. Forskellige mængder af pseudotypede vira (som bestemt af niveauerne af HIV-80 p1-proteinet) blev brugt til at inficere HEK-ACE24-celler og 2 timer senere blev ildflueluciferaseaktivitet målt ved hjælp af Luciferase Assay Reagent (Promega) i en Glomax 48 mikroplade luminometer (Promega).
Neutraliseringsassay
Pseudotypede virusneutraliseringsassays blev udført hovedsageligt som vi tidligere har beskrevet12. Kort fortalt blev seriefortyndinger af plasmaprøverne (1: 4 til 1: 8748) fremstillet i DMEM med 10% føtalt bovint serum og inkuberet med 5 ng p24 af hvert pseudotypet virus i løbet af 1 time ved 37 ° C og derefter 1 × 104 af HEK-ACE2-celler blev tilsat til hver brønd. HEK293T -celler (der ikke udtrykker ACE2) inkuberet med det pseudotypede virus (slægt A) blev anvendt som en negativ kontrol. Celler blev lyseret 48 timer senere, og ildflueluciferaseaktivitet blev målt ved hjælp af Luciferase Assay Reagent (Promega) i et Glomax 96 Microplate luminometer (Promega). Procentdelen af neutralisering for hver fortynding blev beregnet, og ID50 for hver prøve blev beregnet ved hjælp af GraphPad Prism version 9.0.1.
Statistiske analyser
Statistiske analyser blev udført ved hjælp af GraphPad Prism software version 9.1.2. Flere gruppesammenligninger for neutralisering af antistoftitere (NAbT'er) mod et panel af SARS-CoV-2 pseudotypede vira samt sammenligninger af NAbs-svar efter køn og røgstatus blev udført ved hjælp af en parret Wilcoxon-signeret rangeret test. Faktorændring blev beregnet som forskellen mellem geometrisk middeltiter i ID50 sammenlignet med den for vildtype pseudotypet virus. Korrelationsanalyse mellem NAbT'er og alder eller BMI blev udført ved hjælp af Spearmans test. Envejs ANOVA og Tukey's multiple sammenligningstest blev udført til statistisk analyse af infektivitet. En p -værdi ≤0.05 blev betragtet som statistisk signifikant.
Etisk godkendelse
Undersøgelsesprotokollen blev godkendt af Det Etiske Udvalg for Det Medicinske Fakultet ved Universidad de Chile (Projekter nr. 0361-2021 og N ° 096-2020) og Clínica Santa Maria (Projekt nr. 132604-21). Alle donorer underskrev det informerede samtykke, og deres prøver blev anonymiseret.
Virkning af pigmutationerne i Lambda -varianten på infektivitet og neutraliserende antistoffersvar
En analyse af 3695 sekvenser fra Chile deponeret på GISAID pr. 24. junith 2021 viser en klar dominans af SARS-CoV-2-varianterne Gamma og Lambda i løbet af sidste trimester, der tilsammen udgør de 79% af alle sekvenser.
Interessant nok har denne periode været præget af en massiv vaccinationskampagne, hvor 65.6% af målpopulationen (18 år og ældre individer) har modtaget en komplet vaccinationsordning pr. 27. junith 2021
I betragtning af at 78.2% af de mennesker, der blev inokuleret med en komplet ordning, modtog den inaktiverede virusvaccine CoronaVac fra Sinovac Biotech, forsøgte vi at undersøge virkningen af pigmutationerne i Lambda -varianten på neutraliseringskapaciteten af antistoffer fremkaldt af denne vaccine.
Til dette genererede vi HIV-1-baserede SARS-CoV-2 pseudotypede vira, der bærer spike-proteinet fra Wuhan-1-referencelinjen (vildtype; afstamning A), D614G-mutationen (afstamning B) og alfaen (afstamning B .1.1.7), Gamma (slægt P.1) og Lambda (slægt C.37) varianter.
Under virusforberedelse observerede vi konsekvent, at celler inficeret med det pseudotypede virus, der bærer Lambda -piggen, frembragte signifikant højere bioluminescensværdier sammenlignet med D614G -mutanten eller Alpha- og Gamma -varianterne, hvilket indikerer øget infektivitet drevet af Lambda -piggproteinet
Figur 1.Infektivitet medieret af forskellige pigge proteiner.
(A) Skematisk fremstilling af SARS-CoV-2 spike protein og de varianter, der anvendes i denne undersøgelse. Linier er angivet i parentes. RBD, receptorbindende domæne, CM; cytoplasmatisk hale.
(B) Titrering af pseudotyperne for hver slægt ved anvendelse af ækvivalente mængder af HIV-1 p24. Ildflueluciferaseaktiviteten blev målt som relative luminescensenheder (RLU) 48 timer efter infektion. Gennemsnittet og SD blev beregnet ud fra et repræsentativt tredobbelt eksperiment.
Dernæst brugte vi de ovenfor nævnte pseudotypede vira til at udføre neutraliseringsassays ved hjælp af 79 plasmaprøver fra raske sundhedspersonale fra Universidad de Chile og Clínica Santa María i Santiago, Chile.
Vi ekskluderede 4 prøver, da vi ikke var i stand til at beregne en ID50 -titer. Fra de analyserede prøver svarede 73% til kvinder, medianalder 34 år (IQR 29 - 43) og et body max -indeks (BMI) på 25 (IQR 22.7 - 27). En 20.5% af deltagerne erklærede at være aktive rygere, mens immuniseringsperioden varede. Prøver blev opnået i en median på 95 dage (IQR 76 - 96) efter den anden dosis af CoronaVac -vaccinen
Vi observerede, at neutralisering af den pseudotypede virus, der bærer vildtype -protein, resulterede i en 50% hæmmende fortynding (ID50) gennemsnitlig titer på 191.46 (154.9 - 227.95, 95% CI), mens den var 153.92 (115.68 - 192.16, 95% CI), 124.73 (86.2 - 163.2, 95% CI), 104.57 (75.02 - 134.11, 95% CI ) og 78.75 (49.8 - 107.6, 95% CI) for pseudotypede vira, der bærer piggproteinet fra henholdsvis D614G -mutanten eller Alpha-, Gamma- og Lambda -varianterne.
Vi observerede også, at den geometriske middeltiter for ID50 titre faldt med en faktor 3.05 (2.57 - 3.61, 95% CI) for den pseudotypede virus, der bærer Lambda -piggen, 2.33 (1.95 - 2.80, 95% CI) for Gamma -piggen, 2.03 (1.71 - 2.41, 95% CI) for Alpha -piggen og 1.37 (1.20 - 1.55, 95% CI) for D614G -piggen sammenlignet med vildtype -piggen.
Ingen sammenhæng mellem køn, alder, kropsmasseindeks (BMI) eller røgstatus og neutraliserende antistoftitre blev observeret i vores undersøgelseskohorte.
Figur 2.Neutraliseringsassay ved hjælp af plasmaprøver fra CoronaVac -vaccinerede
(A) Ændringer i den gensidige 50% neutraliseringstiter (ID50) i plasmaprøver fra 75 modtagere af CoronaVac -vaccinen mod D614G (slægt B), Alpha (slægt B.1.1.7),
Gamma (slægt P.1) og Lambda (slægt C.37) varianter sammenlignet med vildtype virus. Resultaterne er vist som forskellen i neutraliseringstitere af matchede prøver. P -værdier til sammenligning af ID50 beregnes med Wilcoxon-test med signeret rang.
(B) Box plots angav median og interkvartil område (IQR) for ID50 for hver pseudotypet virus. Faktorændringer vises som forskellen mellem geometrisk middelværdi i id'et50 sammenlignet med dem for vildtype pseudotypet virus. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af Wilcoxon-matchede-par signeret-rangtest.
Sammen afslørede vores data, at spike -proteinet i den nyligt anerkendte variant af interesse Lambda, der er stærkt cirkulerende i Chile og sydamerikanske lande, bærer mutationer, der giver øget infektivitet og evnen til at flygte fra neutraliserende antistoffer fremkaldt af CoronaVac.
